滨州甜菊糖
(一）产物结构和甜味特性用芦-呋喃果糖苷酶在甜菊双糖A苷的丨9位所连葡糖基上引人果糖基后， 甜味特性的变化见表4 - 10。如用细杆菌（—m sp. H - 1 )的芦-呋喃 果糖苷酶在PH6.5, 40弋条件催化蔗糖和甜菊双糖A苷（RA)反应2h，得到果 糖基甜菊双糖A昔（RA-F),果糖基连接在19-0-召-葡糖基的6-0H上
其中，&是离子型和非离子型底物、产物的总分配系数，即底物、产物在水 相浓度与在有机相浓度之比。乙-八叩有2个电离常数1>/^,和#&，分别表示 Z - Asp的C端和羧酸侧链的电离常数。
形成乙酸酯或其他羟酸是最常用的保护羟基的方法，经常是将乙酸酐在吡啶 溶液中（或其他三级胺中）进行乙酰化，或在NaOAc、KOAc或酸（如ZnCl2、 HC1、H2S04和HC丨0<)的催化下进行反应。6，丨'，6^-三苯甲基蔗糖醚与乙酸 酐反应，使其余5个仲羟基全部乙酰化而生成TRISPA，该反应较易进行，将反 应混合物倒人冰水中则可沉淀出6，r, 6^-三氧-三苯基甲基-2, 3，4, 3\ V-五酸蔗糖酯(TRISPA)0其反应式如图3-15所示，反应的关键是控制反应 温度、时间和反应物摩尔比以使反应完全。 酸、50mL溶剂（S)加人干燥的250mL三口反应瓶中，开始搅拌。在15?20T 急性毒理试验是以同时包含甜菊苷和甜菊双糖苷A的提取物为原料的。含有 50%甜菊背和40%甜菊双糖苷的甜菊提取物对大鼠的f?数致死虽LD?为3.4g/kg, 对小鼠的半数致死量为17 ~42g/kg。Med?n认为用双糖A、B、C苷，甜菊醇生糖 苷和卫矛A苷口服喂养小鼠均无毒。Alcashi等人用含双糖A苷和甜菊苷的甜叶菊 水提取液喂养小鼠3个月进行亚急性毒理试验，也没有发现任何有害作用。 挤杻膨胀淀粉时对甜菊苷的转葡糖基得率的影响。酶萤低于900U/g挤IK膨胀淀粉 时，转葡糖基得率随酶摄增加而增加；大于900U/g时，得宇?保持恒定，而环糊 精随酶1：增加反而减少。由于环糊精葡糖基转移酶萤过多会引起一些副反应，如 环糊精水解或歧化反应，而不会增加甜菊苷的转葡糖基得率，因此最佳环糊精葡 糖基转移酶镦为900U/g挤汛膨胀淀粉左右。 出邻亚磺酸苯甲酸屮酯，约lh后用H 酸测试反应终点应褪色。然后加人甲 苯，通氣气氧化，以2%联苯胺乙醉溶 液测试显深墨绿色为终点，静罝分层， 有机层为邻甲酸中酯苯磺酰氣平苯溶 液（简称磺酰氣）。依次将磺酰氣和水 加人胺化锅，在丨0尤时加氨水胺化， 温度可达70T，PH9以上，静置后取 下层铵盐液为邻甲酰苯磺酰亚胺铵溶 液（简称胺化液）。将胺化液放入酸碱 化锅内，加人甲苯和30%的盐酸到pH 为1，酸析后降温至20T.，取甲苯层 水洗去氣化铵得不溶性糖精甲苯溶液。 将此溶液加热，加入碳酸氢钠中和， 调PH至3.8 -4.0,静置后取水层， 加活性炭脱色、过滤，调滤液pH至 7，在70 ~ 75弋减压.浓缩，趁热过滤， 滤液经结晶、干燥得糖精钠。 目前尝试的各种提髙G-6-a得率的方法，都未能获得成功。例如，在巨 大芽孢杆菌培养基中添加适萤的乙酸钠，但得率仍和没有添加时一样。又考虑到 巨大芽孢杆菌能产生维生素B,2，而维生素Bl2包含乙酰基并能被添加到培养基中 的Co2 +所刺激，因此推测Co2+也能刺激巨大芽孢杆菌分泌出G-6-a，但在培 养基中加入Co2‘并没有观察到G-6-a的增长。此外，调节培养基的氧浓度、 pH和氮含量等措施，对提髙G-6-a得率也没有什么效果。 天然Brazzein的氨基酸序列缺少端蛋氨酸（甲硫氨酸）[图5-24 (2)]， 因此合成基因[图5-24 (3)]的第一个密码子前引人起始密码子Met。野生型葡 萄球菌核酸酶中含有4个蛋氨酸，经CNBr解离产生的肽链会影响Brazzein的分离 纯化，因此用快速定点突变将核酸酶基因（SNase)的4个Met的密码子用Ala的 密码子替换。SNase的4个蛋氨酸转化为己氨酸（正亮氨酸）对核酸酶活性没有影 响，SNase中蛋氨酸突变为丙氨酸会降低核酸酶的稳定性。经修饰后融合蛋白中只 有一个的蛋氨酸间隔SNase和SW K [图5-25 (2)],所得的融合蛋白表达水平 高并且核酸酶具有活性。在如-pGlul - Brazzein合成基因的5'和3'端分别加上 Ndel和BamHI位点，这样就可以克隆至任一 pET质粒。通过对天然核酸酶-卵类 黏蛋白融合基因表达质粒进行改造构建新的质粒。将Brazzein合成基因（SW基 因）插人pET-3a表达系统SNase基因C-端的Ndel和BamHI位点之间，得到质 粒PET-3a/SNase-SW [图5-25 (1)]0融合蛋A转录和翻译信号由T7表达载 体PET-3a产生，蛋白质在lac启动子的控制下生产。